Tbx18通过下调EMT信号分子参与调控心脏发育 |
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上皮间充质转化(eithelial-mesenchymal transitions，EMT)是指在某些特殊的生理条件下，上皮细胞失去极性和黏附性获得迁移和运动能力并向间质细胞表型转化的现象[1].EMT过程是器官发育和形成的重要机制[2].Tbx18是近年来新发现的参与心脏发育的一个重要基因[3].既往研究表明，Tbx18来源的心外膜祖细胞是心脏发育过程中第一、第二生心区的重要补充[4]，Tbx18基因敲除小鼠表现为窦房结头部严重缺失[5, 6].由此可见，Tbx18基因在调控心脏发育中扮演重要角色.Cai等[7]运用Tbx18:Cre/Rosa26RlacZ双转基因胚鼠证实，Tbx18+心外膜上皮细胞经历EMT过程侵入心外膜下组织并转化为间充质细胞，这些间充质细胞最终分化为心系细胞并对心脏发育产生重要贡献.我们既往的研究也证实了EMT过程是Tbx18+心外膜上皮细胞参与了心脏发育的重要机制[8]，但具体哪些EMT关键信号分子参与心脏发育，目前尚未见报道.有研究发现，在心脏发育过程中，Tbx18[9, 10]和EMT关键信号分子Snail1、Smad、Slug、Twist在心外膜高表达[11].因此，有理由推测，Tbx18有可能通过调控这些信号分子参与心外膜上皮细胞的分化和心脏的发育.我们利用Tbx18:Cre/Rosa26REYFP双转基因胚鼠和Tbx18基因突变胚鼠研究Tbx18及EMT关键信号分子时空表达规律及其相互关系.探索Tbx18调控心外膜上皮细胞形成心系细胞的可能靶点.
1 材料与方法
1.1 材料
多聚L-赖氨酸氢溴酸盐(P1524)及MgCl2、EGTA、NP-40、胰蛋白酶、HEPES、 NaCl、葡萄糖、MgSO4等试剂购自Sigma 公司；细胞培养瓶、24孔细胞培养板购自 Corning 公司；Ⅱ型胶原蛋白酶购自Worthington(LS004176)；马血清为HyClone产品；高糖 DMEM 培养基、M199 细胞培养基、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)和双抗为Invitrogen 公司产品；GoTaq®Master Mix(M7122)、Wizard®基因组纯化试剂盒(A1120)、组织RNA 提取试剂盒(Roche，NO12033674001)；SYBR GreenⅠ (Roche)；蛋白酶 K(V3021)购自Promega公司；兔Snail1抗体(sc-28199)、兔Slug抗体(sc-15391)，兔Smad抗体(Smad1/5/8，sc-6031-R)、兔Twist 抗体(sc-15393)均购自Santa Cruz公司(1:50)；TRITC 标记抗兔 IgG(ZF-0316)为北京中杉公司生产. 1.2 Tbx18:Cre/R26REYFP双转基因胚鼠和Tbx18基因突变胚鼠的建立和鉴定Tbx18-Cre基因敲入雄性小鼠(杂合状态)由美国加州大学 Evans 教授惠赠[7]，在其杂合子状态下进行繁育(纯合子状态具有致死性).条件性 Cre 报告系统小鼠 Rosa26-EYFP[12] 可以杂合子状态或者纯合子状态与杂合子 Tbx18-Cre 基因敲入小鼠交配(1:2)，22:00交配，次日 8:00 观察，若见阴栓记胚龄 E0.5 天.杂合子 Tbx18-Cre 基因敲入小鼠互交，按照孟德尔遗传定理，有1/4的机会得到Tbx18突变小鼠；杂合子 Tbx18-Cre 基因敲入小鼠和杂合子Rosa26-EYFP报告小鼠交配，同样有1/4的机会得到Tbx18-Cre/Rosa26-EYFP双转基因胚鼠.取少量胚胎组织提取基因组，用 PCR方法筛选Tbx18-Cre 杂合子、Tbx18-Cre/Rosa26-EYFP双转基因胚鼠和Tbx18基因突变胚鼠，具体方法参考文献[7, 11]. 1.3 免疫荧光染色Tbx18基因突变和野生胚鼠、Tbx18:Cre/ R26REYFP双转基因胚鼠(E14.5、E15.5及E16.5)均用免疫荧光染色进行检测.胚胎或者组织在解剖后于 4%多聚甲醛 4℃固定10~30 min，OCT 包埋，冰冻切片(5~10 μm)，然后固定5 min减少内源性YFP的表达，按常规方法进行免疫荧光染色，激光共聚焦显微镜采集图像. 1.4 Western blot 蛋白质定量分析Western-blot蛋白质定量分析Snail1、Slug、Smad、Twist蛋白的表达.方法：用组织裂解液裂解Tbx18突变和野生胚鼠心脏(E16.5)，提取总蛋白，用考马斯亮蓝法进行定量，调节蛋白质浓度后取上样蛋白经 SDS-PAGE 电泳转移至 PVDF 膜上，脱脂奶粉封闭后加入一抗工作液(1:50)，加入二抗进行抗原抗体反应.用凝胶成像系统测定各条带积分灰度值. 1.5 流式细胞分选术Tbx18:Cre/R26REYFP双转基因胚鼠(分别取E12.5、E14.5、E15.5及出生后第一天)心脏分离后转移到HBSS溶液中，洗净血液后剪成小的组织块，组织块用0.05% Ⅱ型胶原蛋白酶和0.06%胰蛋白酶混合液在37℃恒温振荡消化，吸取上清，胎牛血清终止反应，离心搜集细胞，重复消化 4~5次，直到组织全部消化完，得到单个心肌细胞后用流式细胞分选仪 FACS (BD，美国)分选纯化 EYFP+细胞，具体方法参考文献[11]. 1.6 基因表达分析用RNA 提取试剂盒提取Tbx18+心系细胞及野生型和突变胚鼠心脏(E11.5、E13.5、E16.5)总RNA(按照厂家说明书进行).对RNA样品进行浓度及纯度测定之后使用逆转试剂盒逆转录合成cDNA，接着采用SYBR GreenⅠ荧光染料法进行定量PCR反应，用ΔΔCt方法及管家基因GAPDH作为内参计算靶基因的相对表达水平. 1.7 统计学处理结果以x±s表示.两组间的计量资料比较用t检验.P值小于0.05认为有统计学意义. 2 结 果 2.1 Tbx18+心系细胞和EMT关键信号分子在心外膜及心外膜下间充质共聚焦将E16.5天Tbx18:Cre/Rosa26REYFP双转基因心脏进行冰冻切片，由于Cre重组酶可特异性激活报告基因EYFP，EYFP真实地代表了Tbx18+心系细胞.我们观察到发绿色荧光的Tbx18+心系细胞出现在心外膜下间充质包括：左右心室心房壁、室间隔、心脏房室瓣和冠状动脉，这些结果和既往研究一致[3].接着将Tbx18+心系细胞和EMT关键信号分子Snail1、Slug、Smad及Twist蛋白进行共聚焦.结果提示，Tbx18+心系细胞和Snail1、Slug、Smad及Twist在心外膜及心外膜下间充质共定位(图 1).EMT关键信号分子在这些部位的限制性表达，间接提示其作为局部信号可能参与了Tbx18+心外膜细胞EMT过程和心脏的发育，但是否是Tbx18的下游靶点仍需要进一步验证. Fig. 1 Tbx18-expressing epicardial cells and their descendants (EYFP) co-localized with Snail1, Slug Smad and Twist (a~d) E16.5 Tbx18:Cre/ Rosa26REYFP heart cryosections, EYFP efficiently labeled Tbx18-expressing epicardial cells and their descendants. An overlay of EYFP with Snail1(a), Slug(b), Smad(c) and Twist(d) in the interventricular septum (IVS), atrioventricular valves (MV, mitral valve) and coronary artery(CA) revealed that local signals (Snail1, Slug Smad and Twist) in these areas likely involved in the formation of myocardial lineage. The scale bars in all figures represent 150 μm. 图选项 2.2 Tbx18+心系细胞内(E12.5天至出生后第1天)EMT关键信号分子时间表达模式用胶原酶分离不同发育时期(E12.5、E14.5、E15.5、E16.5及出生后第1天)Tbx18:Cre/Rosa26REYFP双转基因心脏的单个心肌细胞，接着用EYFP激活的流式细胞分选术获得了发绿色荧光的Tbx18+心系细胞(图 2a).由于在Tbx18:Cre/R26REYFP双转基因小鼠中Cre重组酶可以特异性地激活EYFP，所以EYFP可以真实地反映Tbx18+心系细胞(心外膜祖细胞及其后代细胞)的时空表达情况.我们称这些Tbx18+心系细胞为EPI细胞.用实时荧光定量PCR比较了这些EMT关键信号分子在不同发育时期心脏EPI细胞内的动态表达模式(图 2b~e).结果发现： Snail1、Slug、Smad1、Twist在E12.5尚处于较低水平，随着Tbx18+心外膜细胞向心脏迁移分化，其表达水平逐渐升高，在E14.5达到最高水平，E15.5开始表达下降，在出生后第1天又降至较低水平，即表现为开口向下的抛物线表达模式.和这些转录因子相反，E-cadherin在E12.5处于较高水平，之后开始下降，在E15.5降至最低水平.之后又开始升高，在出生后第1天达到较高水平，即表现为开口向上的抛物线表达模式(图 2f). Fig. 2 Parabolic expression patterns of the major EMT biomarkers and Tbx18 from E12.5 to postnatal 1day within FACS-sorted Tbx18 lineage cells by qRT-PCR (a) Schematic showing the dissociation and FACS isolation of Tbx18 lineage cells from Tbx18:Cre/R26EYFP hearts from E12.5 to postnatal day 1 for qRT-PCR analysis. (b~e, g) qRT-PCR analysis demonstrated enrichment for four transcriptional factors (Snail1, Slug, Smad, Twist1) and Tbx18 within Tbx18 lineage cells. The expressions of these factors and Tbx18 were significantly upregulated from E12.5~E14.5, while downregulated from E14.5~ postnatal day1. (f) qRT-PCR analysis indicated downregulated expressions of E-cadherin from E12.5~E15.5, while continued upregulated from E15.5 ~postnatal day 1 and high levels being maintained on postnatal day 1. n=3. *P □: KO;: WT. *P (a~e) Snail1 (a), Slug (b), Twist(c) and Smad (d) were markedly reduced and E-cadherin (e) was upregulated in the epicardium and subepicardial mesenchyme within the Tbx18 KO hearts compared with the wild-type hearts, revealing that Snail1, Slug, Smad, Twist and E-cadherin are direct or indirect downstream targets of Tbx18. The scale bars in low-magnification figures represent 300 μm (white scale bars) and those in high-magnification figures represent 150 μm(orange scale bars). 图选项 Fig. 5 Comparison of the mRNA and protein levels of the transcriptional factors Snail1, Slug, Smad, Twist and E-cadherin between Tbx18 KO hearts and the wild-type hearts by qRT-PCR and Western blot analysis (a~c) qRT-PCR analysis indicated the mRNA levels of the transcriptional factors Snail1, Smad, Slug and Twist were significantly reduced in the Tbx18KO hearts at E11.5, E13.5 and E16.5 compared with the wild-type hearts. However, E-cadherin expression was upregulated subsequent to the transcription factors (except E11.5). n=3. *P |
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